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产品名称: 多肽的纯化
产品名称:

多肽的纯化

上市日期: 2016-03-10
  • 产品概述
  • 产品规格
  • 详细参数

氨基酸之间可以通过肽键相连,分子量在5000~3000 之间的肽称为“大肽”;分子量在3000~1000 之间的肽称为“多肽”,分子量在1000~180 之间的称为“小肽”、“寡肽”、“低聚肽”,也称为小分子活性多肽。大多数多肽都是化学合成的,只有非常少的肽是来源于天然提取。更大的肽一般指超过25 氨基酸需要通过重组DNA 的技术表达生产。自然界中20 种氨基酸,按照其取代基团性质差异而呈现不同的酸碱性,疏水性,芳香族或者极性侧链。这些侧链的不同属性可以作为进行色谱分离的基础。多肽的紫外吸收通常在206 nm-220 nm, 如果含有芳香族的基团,紫外的吸收最大值会在268 nm-280 nm 检测到。

 

多肽来源分为:天然肽如激素,某些抗生素,人体内的脑啡肽,谷胱甘肽和细菌的毒素都是天然存在的肽;合成多肽如合成胸腺肽,重组多肽如EGF,及蛋白的多肽消化片段。

 

一、多肽纯化技术简介
1、反相分离技术(首选技术,小肽常用)
SOURCE 骨架的反相层析填料为目前可在中压系统中操作的最小孔径凝胶。与传统的硅胶骨架的反相介质相比,SOURCE 填料能在pH 1-14 稳定工作,并可以用1M NaOH进行清洗再生,高流速低反压,应用范围更广,寿命更长。
• SOURCE 30RPC 适合中度或精细纯化
• SOURCE 15RPC 适合精细纯化
• SOURCE 5RPC 适合分析或精细纯化

 

QQ截图20160310101108.png

 

图1:SOURCE RPC 颗粒在电子显微镜下的图片。每个颗粒都是大小均匀,绝无碎片和破碎颗粒。

 

用Source 5RPC 在pH 9.5 条件下分析用胰酶消化的BSA 的还原肽图 。

System: ÄKTA ™ purifier
Sample: RVP-BSA-mT, ca 750 pmol
Column: SOURCE 5RPC ST 4.6/150
Eluent A: NH4OH/HCOOH, 10 mmol/l, pH 9.5
Eluent B: 60% acetonitrile in eluent A
Gradient: 0–67% B over 115 ml i.e. 46 column volumes (CV)
Flow rate: 0.5 ml/min

 

QQ截图20160310101253.png

 

图2:在高pH 值下进行反相层析分析RVB-BSA-MT 的肽图。

 

合成的阿尔茨海默氏病人中发现的淀粉样蛋白-ß1-42 肽肽粗产物溶解在125 mmol/l,pH 13 的氢氧化钠溶液中, 上柱前再稀释。图2 为优选各种方法, 其结果表明用pH 9.0 氨水/ 甲酸能得到最好的分离。

 

QQ截图20160310101708.png

 

图3:不同pH 条件下用SOURCE 5RPC 反相层析柱分析引起老年痴呆症的淀粉样肽。

 

样品:血管紧张肽Ⅱ和Ⅲ
层析柱:SOURCE 30RPC HR10-10 8ml
流速:4 ml/min

 

QQ截图20160310101746.png

 

图4:在碱性条件下用SOURCE RPC 分离、检测仅相差一个氨基酸的多个血管紧张肽。

 

 2、分子筛技术
是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质。Superdex peptide 专门分离多肽类产品的高分辨率分子筛凝胶,分离的分子量范围为100-7000 Da。高化学稳定性, pH1-14, 兼容有机溶剂 ( 乙腈+TFA)。

 

QQ截图20160310102022.png

 

3、离子交换分离技术
当分离的多肽带有电荷的时候,可以选择用离子交换层析进行分离,通常离子交换会和RPC 及SEC 相结合分离复杂的样品,如酶解多肽片段或者合成多肽,及天然来源的多肽。用于精细分离的离子交换介质,如HP,SOURCE,Mono,Mini 等精细介质非常适合多肽的分离。

 

QQ截图20160310102046.png

 

二、多肽分离技术的综合运用
对于大多数的多肽来说,仅仅一步纯化或一种技术应用是不够的,通常会将反相,离子交换和凝胶过滤这三种技术综合起来进行多步纯化,最终达到高的分辨率。

 

生物提取法:

多步柱层析法是提高胸腺肽α1 的纯度及活性的有效方法。采用DEAE Sepharose Fast Flow 和CM Sepharose Fast Flow 双柱串联连接,0.02 mol/L PB 平衡,NaCl 梯度洗脱纯化。纯化后的Tα1 玫瑰花结率达33% ( 绝
对值) 以上,且与传统的超滤工艺相比过敏反应低,安全性高。由于双离子交换收集的为流穿峰,比较适合规模化生产。

 

QQ截图20160310102337.png

 

 

化学合成法:

就Tα1 的化学合成法的生产工艺而言,Tα1 的纯化通常采用反相色谱法和离子色谱法。反相色谱具有极高的分辨率,可以分离大部分杂质,离子色谱的分离基于带电荷的差异,常作为反相色谱的补充纯化合成多肽。

 

QQ截图20160310102439.png

 

基因工程法:

对于基因工程法来说,将Tα1 与其他标签蛋白进行融合表达,通过亲和层析的方法纯化融合蛋白后,再切除标签,获得重组的Tα1。由于亲和层析高度的特异选择性,所得Tα1 的纯度往往高于95%。

 

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三、不同来源多肽纯化的总结:
• 用SOURCE 骨架的反相填料,可以在更宽的pH 进行工艺优化,具有更强的适用性以分离各种肽类。
• 离子交换技术很适合合成多肽和天然多肽的纯化,特别在粗纯的步骤。
• 如果反相和离子交换技术都效果不好,原因可能是溶解性的问题。
• 使用凝胶过滤如Superdex peptide,Sephadex LH20 都很好的用在多肽纯化中。
• 需要增加选择性,载量和稳定性:用多维纯化方法,可以将离子交换,分子筛和反相层析等多种技术结合,而代替一步反相或反复用反相柱子纯化。

 

 

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