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产品名称: MBP&Strep(ll)标签蛋白的纯化
产品名称:

MBP&Strep(ll)标签蛋白的纯化

上市日期: 2016-03-10
  • 产品概述
  • 产品规格
  • 详细参数

MBP 标签蛋白
麦芽糖结合蛋白(MBP) 有42.5 KD 大小,不含Cys,作为融合蛋白的标签,通常放在N 端在通常在大肠杆菌中进行表达。MBP 能促进融合蛋白的可溶性表达,尤其对于难表达的真核细胞蛋白,膜蛋白,病毒蛋白有很好的促溶表达能力,MBP 融合蛋白的纯化在生理条件下进行,使用麦芽糖进行温和洗脱。保护了MBP 标签蛋白的活性。标签在纯化后期需要用酶切去除,常用的内切酶是Factor Xa,麦芽糖酶和肠激酶。

 

QQ截图20160310122044.png

 

一、MBP 标签蛋白的纯化
MBPTrap ™ HP 1 ml/5 ml 预装柱是带有糊精特异性配基的琼脂糖高效凝胶,载量大约10 mg/ml,填料颗粒是34 um 所以能得到非常集中的纯化峰,同时富集纯化蛋白。洗脱的时候采用10 mM 的麦芽糖竞争性洗脱。预装柱可以直接用0.5 M NaOH 进行再生,并可以多次反复使用。
用AKTAxpress 自动两步纯化MBP 标签蛋白
• 两步纯化制备2.2 mg 蛋白
• 总的纯化时间3.4 h
• 洗脱得到蛋白具有高纯度

 

1st step (AC):
柱子: MBPTrap ™ HP 1 ml
样品: 7 ml MBP2*-paramyosin-δ-Sal (Mr~70 000) in E. coli lysate
结合液:20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.4
洗脱液:10 mM maltose in binding buffer
2nd step (GF):
柱子: HiLoad ™ 16/60 Superdex ™ 200 pg
样品: Eluted pool from MBPTrap HP 1 ml
缓冲液:10 mM sodium phosphate, 140 mM NaCl, pH 7.4

 

QQ截图20160310122333.png

 

Strep(II) 标签蛋白
Strep(II) 标签是只有八个氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) 的小标签,分子量仅有1000,通常不需切除。Strep( II ) 标签可以放在N 端或者C 端也可以在真核细胞中表达,他不能结合抗生物素蛋白(avidin)。为防止宿主中的生物素化的蛋白竞争性结合到柱子上,造成载量偏低,可以在样品中加入抗生物素蛋白屏蔽掉宿主蛋白的干扰。

二、Strep(II) 标签蛋白的纯化
带Strep-Tactin 配基的strepTrap HP 介质能特异性的结合Strep(II) 标签蛋白,结合亲和力是链霉抗生物素蛋白结合亲和力的100 倍,因此纯化strep(II) 标签蛋白非常理想。纯化过程在生理条件下进行,使用脱硫生物素温和程度的洗脱保护了靶蛋白的活性。

大肠杆菌表达的双标签蛋白(His)6-mCherry-Strep(II)的纯化,在不同的规模进行制备。

 柱子: A StrepTrap HP 1 ml
               B StrepTrap HP 5 ml
              C StrepTactinSepharose HP XK 26/20, 29 ml,
样品: (His)6-mCherry-Strep(II) (Mr~31 000), in E. colilysate
结合缓冲液:100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0
洗脱缓冲液:2.5 mM desthiobiotin in binding buffer
再生液: 0.5 M NaOH)
系统: ÄKTAexplorer ™ 100

 

QQ截图20160310134628.png

 

Strep(II) 通常与His 标签一起构建双标签系统,通过两步亲和层析得到高纯度的蛋白,由于strep 的纯化结合过程不受高浓度的咪唑影响,所以常常跟在Ni 亲和后进行双标签蛋白的精细纯化,制备全长的蛋白,同时得到高纯度的样品同时保证纯化得到的蛋白是全长的蛋白。两种小标签通常不需要切除也不会影响蛋白的功能结构。

 

样品: Strep(II)-protein-(His)6,Mr: ≈ 15 000
流速: 0.8 ml/min
Run 1:HisTrap ™ HP 1 ml
Run 2: StrepTrap ™ HP 1 ml

 

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