蛋白复合物的纯化

单独存在的蛋白质并不能执行功能，而需要通过同其它蛋白相互作用来实现，蛋白质复合物是潜在的、非常重要的药物靶点。许多蛋白- 蛋白相互作用能够导致稳定复合物的形成，这些复合物在分子水平上能够被分离并鉴定。例如，抗原 抗体复合物以及蛋白酶 蛋白酶抑制剂复合物。蛋白质复合物能够由10 个甚至100 个以上不同亚基构成。随着不同亚基的大小和数量上升，进行分离纯的难度提高。采用层析的方法可将天然存在的多蛋白复合物（非重组、无亲和标签）纯化出来以用于结构及功能研究。一般设计合理的层析流程，运用不同的层析原理进行分离纯化。用于多蛋白复合物纯化的层析技术以及考虑因素见下表：

一、天然蛋白复合物用pull down 方法纯化
1、串联亲和层析纯化方法（TAP）
TAP 的基本原理就是一个诱饵蛋白（一个已知或假想地复合物组分）同时带上蛋白A 和钙调素结合（CBP）两个标签，在这两个标签之间含有烟草花叶病毒酶（TEV）酶切位点。利用连续两步亲和层析来分离蛋白质复合物。两步亲和层析目的是提高纯化过程的特异性继而降低假阳性出现的几率。本方法所使用的每一个条件都很温和，这样是为了保持复合物的完整性并且保证产量的最大化。

2、GST 亲和pull-down
GST pull-down 用带GST 标签的诱饵蛋白从生物样品中纯化一个或几个蛋白，具有纯化低丰度蛋白复合物的能力。

3、免疫共沉淀IP
使用复合物中一种组分（已知或假想的）的抗体，同其抗原也就是多蛋白复合物的一部分结合用亲和介质protein A或protein G 或带这种蛋白的磁珠通过离心或磁场将抗体蛋白复合物捕获。也可用NHS 活化的Sepharose 自己螯合相关抗体或抗原，进行免疫共沉淀。

二、重组蛋白复合物的分离
对于大量制备蛋白复合物的应用，一般采用重组的方法进行制备，这种方法可用于将分别分离得到的组分组装成复合物。

1、亲和层析纯化人类剪接体145 - 亚基复合物人类剪接体是一个由RNA 和蛋白质构成的145 个亚基复合
物，使用亲和层析作为主要步骤的一种方法纯化获得，最终的纯化步骤是在分子筛上进行。

2、纯化组织相容性复合体Ⅱ（MHC Ⅱ）增强体的亚复合物
RFX 复合物是由3 个蛋白组成：RFXB、RFXAP 和RFX5。RFX5 蛋白是由5 个结构域组成，其中N 端结构域（190）负责多聚化。RFX5 以及不同长度的RFX5 构建体都表达成组氨酸标签的蛋白，RFXAP 可同RFX5 的N 端结构域形成稳定的复合物，因此它们可以被共纯化出来。通过IMAC进行纯化。在变性条件下，对这两个蛋白的复合物进行第二步IMAC 纯化。在穿透液中回收RFXAP，并通过分子筛层析对其进行下一步的复性、浓缩以及纯化。纯化出来的蛋白以及蛋白片断被用于多聚化研究并为RFX 复合物与MHC Ⅱ启动子之间的相互作用构建出一个DNA 结合模型。