包函体柱上复性

包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集, 形成无活性的固体颗粒, 一般有50% 以上的重组蛋白, 其余为核糖体元件、RNA 聚合酶、内毒素、外膜蛋白等，环状活缺口的质粒DNA 以及脂质、多糖等，大小为0.5-1 um，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），无定形，呈非水性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

一、包涵体的溶解：

二、包涵体复性方法

成功复性的关键是反应朝主要目标进行，抑制产生聚集的竞争性路径。一般需要在蛋白浓度，温度，反应时间，添加剂，二硫键交换剂等参数上进行优化。

三、柱上复性的实例
1、分子筛复性有两种方法：一种做法是用复性液平衡分子筛柱，然后将变性的样品直接上柱复性，但直接上变性样品，柱子很容易堵死，不推荐。一种是在上样前，用变性液与复性液在柱上做个梯度，用复性液进行洗脱。

柱子： Superdex 75 10/300 GL
样品： Lysozyme in 8 M urea, 0.2 M DTT
复性液： 0.1 M Tris-HCl, pH 8.7, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 3 mM reduced glutathione (GSH)/0.3 mM oxidizedglutathione (GSSG)
柱子平衡液：6 ml linear gradient from 8 M to 2 M urea in refolding buffer

2、利用Ni Sepharose 层析可以实现组氨酸标签蛋白进行简单有效的纯化和柱上复性方法，可以在将蛋白从柱子上洗脱之前去除杂质并通过改变成非变性缓冲体系使其复性。复性之后的蛋白可根据需要使用其它方法进一步纯化。

结合液： 6 M guanidine hydrochloride, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, 1 mM 2-mercaptoethanol, pH 8.0
溶解液： 6 M urea, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, 1 mM2-mercaptoethanol, pH 8.0

洗脱液： 20 mMTris-HCl, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole, 1 mM 2-mercaptoethanol, pH 8.0
复性液： 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, 1 mM 2-mercaptoethanol, pH 8.0

3、阴离子交换介质和阳离子交换介质都成功的运用在蛋白柱上复性纯化上。任然通过正负电荷相互吸引的作用进行结合，但结合的时候通常需要更低的离子浓度。

柱子： HiTrap Q FF, 1 ml
样品： 1 ml BSA 0.5-20 mg/ml denatured-reduced (contains 17 disulfide bonds)
起始缓冲液： 50 mM Tris-HCl, 3 mM EDTA, 8 M urea, pH 8.5
复性缓冲液r： 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 79 mM urea,1.1 mM oxidized glutathione (GSSG), 2.2 mM reduced glutathione (GSH), pH 8.5 孵育0 to 40 h
清洗缓冲液r： 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.5
洗脱缓冲液r： 0 to 1 M NaCl in 50 mM TrisHCl, pH 8.5