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产品名称: PEG修饰蛋白的纯化
产品名称:

PEG修饰蛋白的纯化

上市日期: 2016-03-10
  • 产品概述
  • 产品规格
  • 详细参数

 用PEG 蛋白药物可以解决许多蛋白药物面临的半衰期过短的问题。PEG 化改善了蛋白的药理学性质,大多数情况下使得它们在临床上更有效。这一技术在过去20 年中发展很快,使得PEG 化成为修饰蛋白质和多肽药物的一个方法。经过采用化学方法聚乙二醇修饰蛋白及多肽药物后,使得原来的纯品蛋白变成了含有oligo-,mono-,non-PEG 蛋白的混合物,我们还需要将均一的PEG - 蛋白纯化出来。

MacroCap SP 和MacroCap Q 设计分离PEG 化蛋白和其他大分子。它们的基架是由丙烯基葡聚糖交联氮氮亚甲基丙烯酰胺构成,具有较大的孔径,平均粒径为50 微米。它们可以在高的载量的条件下分离mono-PEG,oligo-PEG 和non-PEG蛋白。在保持较高载量的同时能一步将修饰后各种杂质去除。高分辨率的凝胶过滤填料Superdex 75、Superdex 200常用于精细纯化和鉴定PEG 化蛋白。

一、PEG 化蛋白纯化的通用工艺

 

QQ截图20160310155900.png

 

PEG-Cytochrome C 的纯化
MacroCap SP 对于monoPEG 细胞色素c 的动态载量达到3.8 mg/ml,通过凝胶过滤superdex 200 5/150 GL 的分析,monoPEG 化蛋白的回收率达到99%,纯度达到93%。

柱子: Tricorn ™ 5/100 装填MacroCap SP
样品: Cytochrome C modified with 20000 Mr PEG
上样: 6 mg total protein per ml medium
Buffer A: 0.02 M sodium phosphate, pH 6.8
Buffer B: Buffer A + 0.4 M sodium chloride

 

QQ截图20160310160129.png

 

PEG-BSA 的纯化
用MacroCap Q 一步纯化PEG-BSA,将它与non-PEG-BSA 和反应副产物进行分离,纯度达到95%,回收率达到85%,载量1 mg/ml。

 

柱子: Tricorn 5/100 装填MacroCap Q
样品: 用30000 Mr PEG 修饰BSA
上样量: 1 mg total protein per mL medium
Buffer A: 20 mM phosphate buffer, pH 7.0
Buffer B: Buffer A + 500 mM NaCl, pH 7.0

 

QQ截图20160310160218.png

 

Mono-PEG-avidin 蛋白的纯化条件优化:
Mono-PEG 蛋白显示对离子交换介质更强的结合能力,因此调整上样时的电导使oligo-PEG 蛋白不能结合到柱子上而穿透。

 

柱子: Tricorn 5/100 packed with 2 ml of MacroCap SP
样品: PEG40 avidin protein mixture,15 mg of protein/ml medium
Buffer A: 0.05 M sodium acetate, pH 5
Buffer B: 0.05 M sodium acetate pH 5, 0.6 M sodium chloride
流速: 0.2 ml/min
梯度: 15–80% buffer B over 15 CV; 100% buffer B over 3 CV

 

QQ截图20160310160317.png

 

柱子: Tricorn 5/100 packed with 2 ml of MacroCap SP
样品: PEG40 avidin protein mixture,15 mg of protein/ml medium
Buffer A: 0.05 M sodium acetate, pH 5
Buffer B: 0.05 M sodium acetate, 0.6 M sodium chloride, pH 5
流速: 0.2 ml/min
梯度: 25–80% buffer B over 12 CV; 100% buffer B over 3 CV

 

QQ截图20160310160347.png

 

PEG-rhG-CSF 纯化
PEG 修饰后的混合物,未修饰产物、多修饰产物和单修饰产物在表面单核效应上存在差异,利用这一特点可以用例子交换层析将其各成分分离开。

 

QQ截图20160310160421.png

 

 

QQ截图20160310160500.png

 

方法二
柱子: XK50/30 of Macrocap SP, 380 ml
样品: PEG-rhG-CSF,300 ml of protein/ml medium
Buffer A: 0.03 sodium acetate, pH 3.8-5.8
Buffer B: 0.03 sodium acetate, pH 7.0-8.0
梯度: 100% A-100% B,20 CV

一步离子交换层析使PEG-rhG-CSF 的纯度达到提高大于99.5%,比活性大于6 × 108 IU/mg。

 

二、如何筛选MacroCap SP 纯化条件
• PEG 在水中不带电荷,是相同分子量球蛋白的体积的六倍以上。
• PEG 趋向在蛋白表面定位,因此对蛋白的电荷有屏蔽作用,对离子交换填料的吸附变弱。
• 吸附采用的缓冲液盐浓度是5 mM 而不是50 mM, 离心的吸附强弱顺序是天然蛋白> 单点PEGylated > 多点
PEGylated 蛋白
• 在赖氨酸位点进行PEG 化的,会使蛋白的等电点减少1pH。因此在用低盐结合以外还需要更低的pH(大约低于
常规条件1-2 pH)进行吸附。
• 起始流速100 cm/h 保留时间6 min 进行调整到最佳状态,用线性梯度盐浓度从5 到 500 mM 进行全面洗脱。

 

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