PEG修饰蛋白的纯化

 用PEG 蛋白药物可以解决许多蛋白药物面临的半衰期过短的问题。PEG 化改善了蛋白的药理学性质，大多数情况下使得它们在临床上更有效。这一技术在过去20 年中发展很快，使得PEG 化成为修饰蛋白质和多肽药物的一个方法。经过采用化学方法聚乙二醇修饰蛋白及多肽药物后，使得原来的纯品蛋白变成了含有oligo-，mono-，non-PEG 蛋白的混合物，我们还需要将均一的PEG - 蛋白纯化出来。

MacroCap SP 和MacroCap Q 设计分离PEG 化蛋白和其他大分子。它们的基架是由丙烯基葡聚糖交联氮氮亚甲基丙烯酰胺构成，具有较大的孔径，平均粒径为50 微米。它们可以在高的载量的条件下分离mono-PEG，oligo-PEG 和non-PEG蛋白。在保持较高载量的同时能一步将修饰后各种杂质去除。高分辨率的凝胶过滤填料Superdex 75、Superdex 200常用于精细纯化和鉴定PEG 化蛋白。

一、PEG 化蛋白纯化的通用工艺

PEG-Cytochrome C 的纯化
MacroCap SP 对于monoPEG 细胞色素c 的动态载量达到3.8 mg/ml，通过凝胶过滤superdex 200 5/150 GL 的分析，monoPEG 化蛋白的回收率达到99%，纯度达到93%。

柱子： Tricorn ™ 5/100 装填MacroCap SP
样品： Cytochrome C modified with 20000 Mr PEG
上样： 6 mg total protein per ml medium
Buffer A： 0.02 M sodium phosphate, pH 6.8
Buffer B： Buffer A + 0.4 M sodium chloride

PEG-BSA 的纯化
用MacroCap Q 一步纯化PEG-BSA，将它与non-PEG-BSA 和反应副产物进行分离，纯度达到95%，回收率达到85%，载量1 mg/ml。

柱子： Tricorn 5/100 装填MacroCap Q
样品： 用30000 Mr PEG 修饰BSA
上样量： 1 mg total protein per mL medium
Buffer A： 20 mM phosphate buffer, pH 7.0
Buffer B： Buffer A + 500 mM NaCl, pH 7.0

Mono-PEG-avidin 蛋白的纯化条件优化：
Mono-PEG 蛋白显示对离子交换介质更强的结合能力，因此调整上样时的电导使oligo-PEG 蛋白不能结合到柱子上而穿透。

柱子： Tricorn 5/100 packed with 2 ml of MacroCap SP
样品： PEG40 avidin protein mixture，15 mg of protein/ml medium
Buffer A： 0.05 M sodium acetate, pH 5
Buffer B： 0.05 M sodium acetate pH 5, 0.6 M sodium chloride
流速： 0.2 ml/min
梯度： 15–80% buffer B over 15 CV; 100% buffer B over 3 CV

柱子： Tricorn 5/100 packed with 2 ml of MacroCap SP
样品： PEG40 avidin protein mixture，15 mg of protein/ml medium
Buffer A： 0.05 M sodium acetate, pH 5
Buffer B： 0.05 M sodium acetate, 0.6 M sodium chloride, pH 5
流速： 0.2 ml/min
梯度： 25–80% buffer B over 12 CV; 100% buffer B over 3 CV

PEG-rhG-CSF 纯化：
PEG 修饰后的混合物，未修饰产物、多修饰产物和单修饰产物在表面单核效应上存在差异，利用这一特点可以用例子交换层析将其各成分分离开。

方法二
柱子： XK50/30 of Macrocap SP, 380 ml
样品： PEG-rhG-CSF，300 ml of protein/ml medium
Buffer A： 0.03 sodium acetate, pH 3.8-5.8
Buffer B： 0.03 sodium acetate, pH 7.0-8.0
梯度： 100% A-100% B，20 CV

一步离子交换层析使PEG-rhG-CSF 的纯度达到提高大于99.5%，比活性大于6 × 108 IU/mg。

二、如何筛选MacroCap SP 纯化条件
• PEG 在水中不带电荷，是相同分子量球蛋白的体积的六倍以上。
• PEG 趋向在蛋白表面定位，因此对蛋白的电荷有屏蔽作用，对离子交换填料的吸附变弱。
• 吸附采用的缓冲液盐浓度是5 mM 而不是50 mM， 离心的吸附强弱顺序是天然蛋白> 单点PEGylated > 多点
PEGylated 蛋白
• 在赖氨酸位点进行PEG 化的，会使蛋白的等电点减少1pH。因此在用低盐结合以外还需要更低的pH（大约低于
常规条件1-2 pH）进行吸附。
• 起始流速100 cm/h 保留时间6 min 进行调整到最佳状态，用线性梯度盐浓度从5 到 500 mM 进行全面洗脱。