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Products 层析介质应用
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氨基酸之间可以通过肽键相连,分子量在5000~3000 之间的肽称为“大肽”;分子量在3000~1000 之间的肽称为“多肽”,分子量在1000~180 之间的称为“小肽”、“寡肽”、“低聚肽”,也称为小分子活性多肽。大多数多肽都是化学合成的,只有非常少的肽是来源于天然提取。更大的肽一般指超过25 氨基酸需要通过重组DNA 的技术表达生产。自然界中20 种氨基酸,按照其取代基团性质差异而呈现不同的酸碱性,疏水性,芳香族或者极性侧链。这些侧链的不同属性可以作为进行色谱分离的基础。多肽的紫外吸收通常在206 nm-220 nm, 如果含有芳香族的基团,紫外的吸收最大值会在268 nm-280 nm 检测到。 多肽来源分为:天然肽如激素,某些抗生素,人体内的脑啡肽,谷胱甘肽和细菌的毒素都是天然存在的肽;合成多肽如合成胸腺肽,重组多肽如EGF,及蛋白的多肽消化片段。 一、多肽纯化技术简介1、反相分离技术(首选技术,小肽常用)SOURCE 骨架的反相层析填料为目前可在中压系统中操作的最小孔径凝胶。与传统的硅胶骨架的反相介质相比,SOURCE 填料能在pH 1-14 稳定工作,并可以用1M NaOH进行清洗再生,高流速低反压,应用范围更广,寿命更长。• SOURCE 30RPC 适合中度或精细纯化• SOURCE 15RPC 适合精细纯化• SOURCE 5RPC 适合分析或精细纯化  图1:SOURCE RPC 颗粒在电子显微镜下的图片。每个颗粒都是大小均匀,绝无碎片和破碎颗粒。 用Source 5RPC 在pH 9.5 条件下分析用胰酶消化的BSA 的还原肽图 。System: ÄKTA ™ purifierSample: RVP-BSA-mT, ca 750 pmolColumn: SOURCE 5RPC ST 4.6/...
重组细胞因子是利用基因工程技术生产的细胞因子的产品,作为药物用于治疗肿瘤、感染、造血障碍等,可收到良好的疗效。通过基因工程技术和多种层析分离技术表达纯化的高纯度活性细胞因子可以有效促进免疫细胞、干细胞的体外生长,用于细胞治疗等相关研究领域。多种相关新药已经上市。 近年出现的动物细胞表达的细胞因子具有完整的糖基化等翻译后修饰,避免蛋白复性,稳定的天然构象使因子比活和长期稳定性有显著改进,逐渐成为技术发展趋势。新型Capto 系列层析填料,为来自不同表达系统的多种细胞因子提供高效的生产纯化技术工具,通过对于宿主杂蛋白、DNA以及未糖基化修饰完全的变体和异构体的有效去除,成功得到多种性质均一的活性细胞因子,提高比活性。常见的重组细胞因子有:干扰素(Interferon, IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、集落刺激因子(colony-stimulating factor)、趋化因子(chemokine)、生长因子(growth factor, GF)、白细胞介素系列(interleukin,IL)等。   一、原核表达细胞因子的纯化工艺1、重组人干扰素α2b(rh-IFNα2b) 的纯化:2、肿瘤坏死因子(TNF) 纯化工艺:3、重组人集落刺激因子(rhG-CSF) 纯化工艺: 4、趋化因子(chemokine) 纯化工艺:   二、动物细胞表达细胞因子纯化工艺相比细菌原核表达的细胞因子而言,哺乳动物细胞,如HEK293 人细胞表达过程中避免了包涵体形成和复性,天然的正确折叠构象和翻译后修饰有利于提高比活性。GE Healthcare 可以提供多种层析分离技术,用于高纯度细胞因子的纯化、生产和分析。1、重组人肿瘤坏死因子(TNFa) 纯化工艺: C...
抗体是一大类能与抗原产生特异性结合的蛋白,抗体也叫免疫球蛋白(Ig)是体液免疫的重要效应分子,介导B 细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白。抗体的应用有:• 治疗性应用:癌症治疗/ 免疫性疾病治疗• 诊断应用:体内诊断/ 体外诊断/ 检测试剂• 分析应用:酶联免疫分析/ 抗体芯片• 结构功能研究:蛋白的结构与功能抗体结构与功能Ig 是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成的4 肽链分子,称为Ig 的基本结构。根据重链C 区氨基酸组成及顺序不同,将重链分为:γ、α、μ、δ、ε。根据重链组成不同,将Ig 分为五类:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。轻链区可以分为kappa 轻链和Lambda 轻链两种类型。 可变区指轻链和重链中氨基酸序列变化较大的区域(V 区)。V 区位于Ig 分子的N 端,占轻链的1/2 和重链的1/4 或1/5。这种变异决定了抗体与抗原结合的特异性。恒定区是指免疫球蛋白轻链和重链中氨基酸序列较保守的区域(C区)。C 区位于Ig 分子的C 端,占轻链的1/2 和重链的3/4 或4/5;小分子抗体片段药物,因为缺乏Fc 片段仍保留着轻链及可变区,能特异性靶向结合目标分子,易于用原核系统进行表达。由于它们的分子量小,更容易的组织渗透而适合很多诊断及治疗应用。近年来小分子抗体药物产品正在快速发展。  GE 公司针对抗体和小分子抗体片段提供高特异亲和层析技术为核心的纯化技术平台,亲和层析粗纯一步即可达到很高的纯度和回收率,对于大部分应用就已经足够。对于对抗体药物质量要求更为严格的应用,在亲和层析之后,除了可以采用离子交换,凝胶过滤等常规的高分辨率精纯技术外,还可以应用我公司新推出的高分辨率多模式填料进行精细纯化,以满足生物制药的需求。 一、IgG 的纯化来源于金黄色葡萄球菌的Protein A 能...
组氨酸标签被广泛的使用,因为它们小,几乎不干扰靶蛋白的功能、活性和结构。固定的金属离子亲和层析(IMAC)是纯化组氨酸标签蛋白的最常用方法。二价金属离子螯合到亲和填料上,还可以与组氨酸等氨基酸以配位键结合,从而快速的纯化出标签蛋白。由于宿主蛋白也存在组氨酸和/ 或半胱氨酸氨基酸残基,其它的非特异蛋白与靶蛋白一起与金属离子亲和层析柱料发生结合,造成纯化样品纯度不高,在这种情况下,上样咪唑的浓度提高,换Co2+ 离子亲和或者加多一步分子筛技术都是很好的解决方法。 一、his 标签蛋白的纯化工具Ni Sepharose FF 和Ni Sepharose HP具有高载量,达到40 mg/ml 填料。低Ni 离子脱落,在低浓度的还原剂存在下,脱落  TALON Superflow比Ni 亲和结合力弱,容易洗脱,带来更高的纯度。结合缓冲液:50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.4清洗缓冲液:50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl1, 5 mM imidazole,pH 7.4洗脱缓冲液:50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl1, 150 mMimidazole,pH 7.4  HisTrap ™ FFcrude/HiTrap ™ TALONcrude 1 ml/5 ml ——直接结合未澄清的样品  直接用注射器操作上未澄清的样品,节省40-80 分钟时间。降低目标蛋白质被降解的机会。提高低丰度蛋白的纯化回收率。每毫升凝胶结合高达40 mg 组氨酸融合蛋白质。兼容各种还原性试剂如 DTE,DTT,β-ME,变性剂如尿素,盐酸胍,去垢剂等等。Ni sepharose excel ——直接从CHO 细胞上清中纯化蛋...
谷胱甘肽-S 转移酶(GST) 基因融合蛋白生产系统是表达、纯化和检测 E. coli 生产的GST 标签蛋白的多功能系统。GST 谷胱甘肽转移酶能特异的与谷胱甘肽结合,表现为酶和底物的作用原理,从而利用这个原理,将GST 做成标签表达出融合蛋白,与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合,从而纯化出目标蛋白,再用特异性的酶将GST 标签切除从而得到天然蛋白。GST 融合蛋白纯化的特点有:纯度高,纯化条件温和保持蛋白活性,促进蛋白可溶性表达。一、Vector 系统  二、表达菌株高通量筛选的工具MultiTrap FF,GST MultiTrap 4B筛选工作可以用于高表达菌株的筛选,也可以用于筛选最佳的样品处理条件或者结合洗脱条件。 96 孔板预装GST MultiTrap FF样品: 未澄清的E. coli BL21 裂解液含 GST-taggedhippocalcin,Mr 45 000纯化方法: 根据说明书, 28-4070-75样品体积: 500 μl系统体积: 3×200 μl结合缓冲液: 10–20 Mm PBS; 50–100 mM Tris-HCl; pH 6.2–8.0;140–400 mM NaCl; 0–5 mM DTT;0% to 5% glycerol and 0–2 mM glutathione.洗脱缓冲液: 50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0洗脱方法: 离心  三、应用于快速纯化标签蛋白的预装柱GSTrap FF使用方便的预装柱结合注射器、泵或者色谱系统,GST 标签蛋白的纯化常常可以一步获得。柱子: GSTrap FF 1 ml样品: 8 ml 大肠杆菌可溶表达GST fusion protein 裂解液结合缓冲液:PBS,...
MBP 标签蛋白麦芽糖结合蛋白(MBP) 有42.5 KD 大小,不含Cys,作为融合蛋白的标签,通常放在N 端在通常在大肠杆菌中进行表达。MBP 能促进融合蛋白的可溶性表达,尤其对于难表达的真核细胞蛋白,膜蛋白,病毒蛋白有很好的促溶表达能力,MBP 融合蛋白的纯化在生理条件下进行,使用麦芽糖进行温和洗脱。保护了MBP 标签蛋白的活性。标签在纯化后期需要用酶切去除,常用的内切酶是Factor Xa,麦芽糖酶和肠激酶。  一、MBP 标签蛋白的纯化MBPTrap ™ HP 1 ml/5 ml 预装柱是带有糊精特异性配基的琼脂糖高效凝胶,载量大约10 mg/ml,填料颗粒是34 um 所以能得到非常集中的纯化峰,同时富集纯化蛋白。洗脱的时候采用10 mM 的麦芽糖竞争性洗脱。预装柱可以直接用0.5 M NaOH 进行再生,并可以多次反复使用。用AKTAxpress 自动两步纯化MBP 标签蛋白• 两步纯化制备2.2 mg 蛋白• 总的纯化时间3.4 h• 洗脱得到蛋白具有高纯度 1st step (AC):柱子: MBPTrap ™ HP 1 ml样品: 7 ml MBP2*-paramyosin-δ-Sal (Mr~70 000) in E. coli lysate结合液:20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.4洗脱液:10 mM maltose in binding buffer2nd step (GF):柱子: HiLoad ™ 16/60 Superdex ™ 200 pg样品: Eluted pool from MBPTrap HP 1 ml缓冲液:10 mM sodium phosphate, 140 mM NaCl, pH 7.4  Strep...
膜蛋白质在基础生理过程( 如分子转运, 信号转导, 能量利用以及细胞核组织结构的维护) 具有极其重要的作用。基因组序列中大约有30% 的基因编码的是膜蛋白, 其中50% 是目前已知药物的靶点。膜蛋白一般由一个或多个跨膜片段构成. 其中跨膜的成分由单链的及成簇的α 螺旋或β 折叠结构组成, 相应的膜蛋白质则被称为α 螺旋膜蛋白或β 折叠膜蛋白。膜蛋白纯化和分析都有很大的挑战,首先是膜蛋白很难制备大量,通常膜的体积只有细胞体积的0.3%,通过基因重组过表达来生产膜蛋白通常对细胞具有毒性,很难实现大规模的生产。常规的膜蛋白都是与细胞膜结合,要分离制备首先是用去垢剂将其溶解纯化,然后去除去垢剂人工构建磷脂双分子层,再进行功能和活性的研究。 一、膜蛋白纯化的通用工艺  二、膜蛋白的纯化目前重组过表达的形式生产膜蛋白是最常用的方法。而大部分膜蛋白都带有亲和的标签,his-tag 是最常用的标签。对于膜蛋白表达的亲和标签:• 连接在C 端,• 如果是his-tag 用更长的标签8-10 个his。• 在标签和蛋白之间插入酶切位点。1、His MultiTrap ™可以用于膜蛋白表达的筛选Dot-Blot 分析是常用于带标签的膜蛋白克隆株的筛选,FOSCholine-12 (FC12) 试剂溶解融合膜蛋白后,用his-tag 抗体进行免疫反应找出高表达菌株。  2、细胞膜的分离:细胞破碎后通过离心和凝胶过滤技术都可以成功的将细胞膜从细胞碎片中分离出来。  3、膜蛋白的溶解:它是整个膜蛋白制备过程中最关键的步骤。通过溶解过程,用去污剂将膜蛋白从它们所处的自然环境(脂膜)中提取至水溶性环境。去污剂可以打破脂双层,并将膜蛋白和脂类包裹进去污剂微胶束中。因此方便蛋白质的分离。  4、放大纯化:从kit 找到的...
单独存在的蛋白质并不能执行功能,而需要通过同其它蛋白相互作用来实现,蛋白质复合物是潜在的、非常重要的药物靶点。许多蛋白- 蛋白相互作用能够导致稳定复合物的形成,这些复合物在分子水平上能够被分离并鉴定。例如,抗原 抗体复合物以及蛋白酶 蛋白酶抑制剂复合物。蛋白质复合物能够由10 个甚至100 个以上不同亚基构成。随着不同亚基的大小和数量上升,进行分离纯的难度提高。采用层析的方法可将天然存在的多蛋白复合物(非重组、无亲和标签)纯化出来以用于结构及功能研究。一般设计合理的层析流程,运用不同的层析原理进行分离纯化。用于多蛋白复合物纯化的层析技术以及考虑因素见下表:  一、天然蛋白复合物用pull down 方法纯化1、串联亲和层析纯化方法(TAP)TAP 的基本原理就是一个诱饵蛋白(一个已知或假想地复合物组分)同时带上蛋白A 和钙调素结合(CBP)两个标签,在这两个标签之间含有烟草花叶病毒酶(TEV)酶切位点。利用连续两步亲和层析来分离蛋白质复合物。两步亲和层析目的是提高纯化过程的特异性继而降低假阳性出现的几率。本方法所使用的每一个条件都很温和,这样是为了保持复合物的完整性并且保证产量的最大化。  2、GST 亲和pull-downGST pull-down 用带GST 标签的诱饵蛋白从生物样品中纯化一个或几个蛋白,具有纯化低丰度蛋白复合物的能力。3、免疫共沉淀IP使用复合物中一种组分(已知或假想的)的抗体,同其抗原也就是多蛋白复合物的一部分结合用亲和介质protein A或protein G 或带这种蛋白的磁珠通过离心或磁场将抗体蛋白复合物捕获。也可用NHS 活化的Sepharose 自己螯合相关抗体或抗原,进行免疫共沉淀。  二、重组蛋白复合物的分离对于大量制备蛋白复合物的应用,一般采用重组的方法进行制备,这种方法可用...
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集, 形成无活性的固体颗粒, 一般有50% 以上的重组蛋白, 其余为核糖体元件、RNA 聚合酶、内毒素、外膜蛋白等,环状活缺口的质粒DNA 以及脂质、多糖等,大小为0.5-1 um,具有很高的密度(约1.3 mg/ml),无定形,呈非水性,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。一、包涵体的溶解:  二、包涵体复性方法  成功复性的关键是反应朝主要目标进行,抑制产生聚集的竞争性路径。一般需要在蛋白浓度,温度,反应时间,添加剂,二硫键交换剂等参数上进行优化。  三、柱上复性的实例1、分子筛复性有两种方法:一种做法是用复性液平衡分子筛柱,然后将变性的样品直接上柱复性,但直接上变性样品,柱子很容易堵死,不推荐。一种是在上样前,用变性液与复性液在柱上做个梯度,用复性液进行洗脱。柱子: Superdex 75 10/300 GL样品: Lysozyme in 8 M urea, 0.2 M DTT复性液: 0.1 M Tris-HCl, pH 8.7, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 3 mM reduced glutathione (GSH)/0.3 mM oxidizedglutathione (GSSG)柱子平衡液:6 ml linear gradient from 8 M to 2 M urea in refolding buffer  2、利用Ni Sepharose 层析可以实现组氨酸标签蛋白进行简单有效的纯化和柱上复性方法,可以在将蛋白从柱子上洗脱之前去除杂质并通过改变成非变性缓冲体系使其复性。复性之后的蛋白可根据需要使用其它方法进一步纯化。结合液: 6 M guanidine hydrochloride, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M ...
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